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本试剂盒可用于体外转录RNA的添加Cap1帽结构的加帽反应，使加帽反应在1h之内完成，效率接近100%，并且保证正确的方向。体外转录(IVT)推荐使用T7体外转录试剂盒(货号：JN3061)。

牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5′末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1和D12）组成，D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5′N都是必须的（图1）。

由牛痘病毒加帽酶构建的带帽RNA产品具有“cap 0”结构。通过在加帽反应中同时使用Cap0帽结构mRNA 2'-O-甲基转移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以转化为“ cap 1”结构。Cap0帽结构mRNA 2'-O-甲基转移酶通过将甲基从供体分子SAM转移到Cap0- RNA 5’端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置，从而从Cap 0-RNA制备Cap 1-RNA。

图1.参与mRNA加帽的酶促途径。Cap 0结构RNA的产生需要牛痘病毒加帽酶：该酶兼具三磷酸酶、鸟苷转移酶和鸟嘌呤甲基转移酶的功能。其中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基供体。一旦产生了Cap 0结构，就可以通过2'-O-甲基转移酶进一步修饰以产生Cap 1结构。

• SAM：SAM在pH7～8，37℃条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。为避免SAM降解，该工作液需要保存于冰上。
  
• RNA：在加帽体系使用之前，应将体外转录反应产生的RNA进行纯化并溶解于RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA溶液或其他盐溶液中。
  
• RNA二级结构：一些RNA转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热RNA可以去除转录产物5′端的二级结构，如果转录产物的5′端结构复杂，可以把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min。
  
• Cap 0-和Cap 1-mRNA：Cap 0-和Cap 1-mRNA之间的差异在RNA 5'端紧邻帽结构的第一位核苷酸（N1）是否具有2'-O-甲基。在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1结构提高了mRNA的翻译效率。
  
  
• Poly(A)尾：如果加帽的RNA需要添加3'-poly(A)尾巴，可以使用百奥莱博E.coli Poly(A) Polymerase（货号：M012）进行加尾。加帽和加尾后的RNA需在进行RNA转染实验前做纯化处理。
  
• RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入0.5μL百奥莱博的RNase抑制剂（货号：JN0013），同时去掉等体积的RNase-free水。

• RNA三磷酸酶将RNA 5'-三磷酸裂解为二磷酸。
  pppN₁(p)N_x-OH(3') → ppN₁(pN)_x-OH(3') + Pi
  
• RNA鸟苷酸转移酶将GTP连接到RNA N1的5'-二磷酸。
  ppN₁(pN)_x-OH(3') + GTP → G(5')ppp(5')N₁(pN)_x-OH(3') + PPi
  
• 鸟嘌呤7-甲基转移酶，使用S-腺苷甲硫氨酸作为辅助因子，催化鸟嘌呤的7-氮甲基化。
  G(5')ppp(5')N₁(pN)_x-OH(3') + AdoMet → m7G(5')ppp(5')N₁(pN)_x-OH(3') + AdoHyc
  
• mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶能在Cap 0-RNA 5′末端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2′-O上添加甲基基团。
  m⁷GpppN₁(pN)_x-OH(3') + AdoMet m⁷Gppp[m^2’-O]N₁(pN)_x-OH(3') + AdoHyc

• 用RNase-free water将适量RNA稀释至67μL。
  
• 将RNA置于65℃加热5min，结束后冰上放置5min。
  
• 按下表加入各成分，配制100μL反应体系。
  

  成分	用量
  Denatured RNA	67μL
  10×Capping Buffer	10μL
  GTP(10mM)	10μL
  SAM(20mM)	2.5μL
  Recombinant RNase Inhibitor(40U/μL)	2.5μL
  mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase(100U/μL)	4μL
  Vaccinia Capping Enzyme(10U/μL)	4μL

  
  
• 37℃反应30min。RNA加帽完成，可进行后续实验。

• 加帽效率低有哪些原因及解决方法？
  
  • 在加帽反应之前，应将IVT产生的RNA纯化去除残留蛋白质，污染物和未结合核苷酸，并溶解在RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA或其他盐溶液中；
    
  • SAM在室温下会慢慢降解，需始终放置在冰上，由于SAM的降解导致的N7甲基化效率低，会进一步导致加帽失败；
    
  • 可以适当增加RNA热变性的条件，把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min；
    
  • 某些RNA会在5'末端形成稳定结构（如同源二聚体，发卡结构），限制加帽酶靠近。分析序列后可以将RNA变性温度增加。如5'末端高度结构化，需要通过分子生物学技术来修改序列。通常可以通过在转录RNA（非编码区）的DNA模板前5个碱基中进行单点突变来实现。
• 缓冲液出现白色沉淀如何解决？
  
  • 将反应缓冲液在37℃孵育5min，彻底混匀以溶解沉淀物；
    
  • 不要将试剂盒储存于-70℃。